免疫系统对癌症治疗的反应可以反映患者在治疗之后是否会有良好的结果。了解肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生和治疗反应中的变化对制定个性化的治疗方案并改善癌症治疗至关重要。借助稳定和全面的超多标成像技术，可使用免疫标志物探查髓系和淋巴系细胞的谱系和结构，而且结合特定肿瘤生物标志物时，还可以捕捉多种肿瘤中TME内的免疫反应。细胞类型特征模式，结合超多标组织成像的探查能力，可以针对免疫细胞群和TME内众多类型细胞的空间相互作用提供之前无法获得的全新认识。

Cell DIVE超多标成像分析整体解决方案可以使用循环染色和染料失活流程对一个完整组织切片上的数十个生物标志物进行检测和成像。Cell DIVE的核心是一个精确、灵活、开放的多标记成像解决方案，可以灵活选择多标记成像研究中常用的生物标志物抗体。Cell Signaling Technology(CST)拥有丰富的经IHC验证的抗体组合，可检测TME中的关键蛋白质，实现组织中的免疫细胞检测和表型判断。CST提供抗体偶联物，这些偶联物均经过验证，可用于Cell DIVE上，并提供经IHC验证抗体与荧光团和其他检测试剂的定制化偶联。CST采用严格的IHC验证方法，随后还会在Cell DIVE平台上进行验证，可确保成功检测蛋白质。

在本研究中，我们展示了使用由数十种CST生物标志物抗体^™组成的新型检测模式，在多种组织类型中进行的Cell DIVE超多标成像。多标记检测模式的开发所需的优化极少，可识别复杂的细胞类型，并揭示肿瘤微环境中的细胞间相互作用。

表征肿瘤微环境有助于理解导致患者预后不佳的新机制。肿瘤微环境比较复杂，通常在单个样本和不同患者样本中都是异质的。循环多标记染色和成像可在不同组织样本中实现TME探查，即使可用组织有限的情况下。在这项研究中，我们检查了12个完整组织或TMA切片中30多个生物标志物的表达（表1），重点是潜在的免疫治疗目标、预测性生物标志物和分割标志物。所有的CST生物标志物抗体均被连接并随机分配到一个回合。

为了在TME中其他细胞的背景下定义免疫细胞，融合并分割了所有的生物标志物图像，并使用聚类分析和降维（UMAP）对表达进行分析。聚类分析提供了一个无偏见的方法来定义组织内的免疫细胞贡献。

在这项研究中，我们展示了人类结肠腺癌（CAC；图1）的聚类分析。在这里，聚类分析将白细胞从所有其他上皮细胞和基质细胞类型中区分出来（图1C）。此外，聚类清楚地定义了淋巴细胞和骨髓细胞类别。CAC中的骨髓类亚型包括骨髓祖细胞、M2巨噬细胞和另外两个未知亚型的骨髓聚类。其他生物标志物可用于进一步定义亚型。对于淋巴类，定义了T细胞和NKT细胞聚类。另外，还确定了一个具有CD20阳性的T细胞聚类。使用机器学习进行单细胞表型分析，可以从聚类中进一步定义细胞类型。例如，在图像1D中，聚类15中的一个细胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（图1D-E；橙色圈）。聚类和单细胞空间分析被应用于研究中的所有其他组织（图2；数据未显示）。

CST抗体经过了严格的验证，以确保抗体在FFPE组织上的表现。本研究中的所有抗体都是直接偶联或商业偶联物成品（表1）。偶联是使用非位点特异性化学方法进行的。抗体与四种不同的染料过量偶联，去除未结合的染料，并通过分光光度分析测量标记的程度。经过初步验证，具有佳标记程度和浓度的偶联抗体溶液随后用于对各种人类癌症组织和正常组织的染色。组织从商业来源获得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI对组织进行成像，并自动进行自发荧光去除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的zhuanli软件全拼接图像进行导入、融合和分析。