1 适用范围

本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。

本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。

2 规范性引用文件

本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

GB/T 6920 水质 pH 值的测定玻璃电极法

GB/T 13267 水质 物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法

HJ 91.1 污水监测技术规范

HJ 506 水质 溶解氧的测定 电化学探头法

HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范

HJ/T 164 地下水环境监测技术规范

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

鱼卵 fish egg

指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录 A。

3.2

稀释倍数 dilution level

原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用 D 来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数 D=1；取 250 ml 水样稀释至 1000 ml（即体积分数为 25%），则稀释倍数D=4。

3.3

低无效应稀释倍数 lowest ineffective dilution

测试中不产生测试效应的低稀释倍数，本标准指不少于 90%鱼卵存活时水样的低稀释倍数，用 LID 表示。

3.4

半数效应浓度 EC50

指暴露48 h 后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用EC50表示。本标准中 EC50即半数致死浓度 LC50。

3.5

参比物质 reference substance

测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中 3,4-二氯苯胺。

4 方法原理

使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将 4-细胞期～128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在 26℃±1℃的条件下培养 48 h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算 LID 或 EC50 值，表征水样的急性毒性。

5 干扰和消除

水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8） 中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。

6 试剂和材料

6.1 受试生物

6.1.1 种鱼

使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长 3.5 cm 左右，鱼龄在 6 月～24 月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前 6 个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录 B。

6.1.2 鱼卵

确保试验鱼卵受精率≥70%，处于 4-细胞期～128-细胞期（见附录 A）。

6.2 试剂

除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满足 pH 值 6.5～8.5，电导率＜10 μS/cm 的要求。

6.2.1 氢氧化钠（NaOH）。

6.2.2 氯化钙（CaCl2·2H2O）。

6.2.3 硫酸镁（MgSO4·7H2O）。

6.2.4 碳酸氢钠。

6.2.5 氯化钾（KCl）。

6.2.6 3,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），优级纯。

6.2.7 盐酸：ρ（HCl）=1.19 g/ml。

6.2.8 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。

量取 8.3 ml 盐酸（6.2.7），用水定容至 1 000 ml。

6.2.9 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1 mol/L。

称取 4 g 氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。

6.2.10 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液：ρ（C6H5Cl2N）=100 mg/L。

称取 0.05 g 3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定容至 500 ml，静置 24 h，调节 pH 值至 7.0。避光冷藏保存，储备液可储存 6 个月。

6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液：ρ（C6H5Cl2N）=3.7 mg/L。

量取 3.7 ml 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水（6.2.16）定容至 100 ml，使用前按 8.2.1 步骤平衡至 26℃±1℃。该溶液作为阳性对照，临用前现配。

6.2.12 氯化钙储备液：ρ（CaCl2·2H2O）=11.76 g/L。

称取 11.76 g 氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.13 硫酸镁储备液：ρ（MgSO4·7H2O）=4.93 g/L。

称取 4.93 g 硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.14 碳酸氢钠储备液：ρ（NaHCO3）=2.52 g/L。

称取 2.52 g 碳酸氢钠（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.15 氯化钾储备液：ρ（KCl）=0.22 g/L。

称取 0.22 g 氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。

6.2.16 标准稀释水。

将氯化钙储备液（6.2.12）、硫酸镁储备液（6.2.13）、碳酸氢钠储备液（6.2.14）和氯化钾储备液（6.2.15）四种储备液各 25 ml 混合，用水定容至 1 000 ml。

7 仪器和设备

7.1 冷藏采样箱：2℃～8℃；

7.2 pH 计：测量范围 0～14，小分度为 0.1 pH 单位；

7.3 溶解氧测定仪：测量范围 0 mg/L～20 mg/L，小分度为 0.1 mg/L；

7.4 倒置显微镜或体视显微镜：小放大倍数为 30×；

7.5 冰箱：冷藏室 2℃～8℃；冷冻室≤-18℃；

7.6 恒温培养箱或恒温室：温度可调至 26℃±1℃；

7.7 斑马鱼养殖系统：包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统；

7.8 多孔细胞培养板：每孔容积 2.5 ml～5 ml 或采用其它相同功能的细胞培养板，可选择市售；

7.9 产卵盒：惰性材料，推荐尺寸：20 cm×10 cm×11 cm（参见附录 C），可选择市售；

7.10 温度计：0℃～50℃；

7.11 塑料滴管：5 ml，口径大于 3 mm；

7.12 一般实验室常用器皿和设备。

8 样品

8.1 样品的采集和保存

根据样品性质及监测需要使用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器）按照HJ 91.1、HJ/T 91 或 HJ/T 164 的要求进行水样的采集，水样沿瓶内壁缓慢倒入，并与瓶塞间不留空隙。

水样采集后，立即于 2℃～8℃避光运输和保存，并尽快进行试验，保存时间长不超过 48 h。水样若需长期保存，则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻（≤-18℃）保存， 保存前将水样充分混匀后按每 1000 ml 容器盛装 500 ml～700 ml 水样的量分装，保存期不超过 2 个月。

8.2 样品预处理

8.2.1 温度

冷冻保存的水样需在不超过 25℃水浴轻微振荡解冻，或在 2℃～8℃冷藏过夜解冻。受试水样在试验开始前，放置于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，26℃±1℃避光平衡至恒温后用于试验。

8.2.2 pH 值

按照 GB/T 6920 方法测定水样 pH 值。当 pH 值＜6.5 或 pH 值＞8.5 时，使用盐酸溶液（6.2.8）或氢氧化钠溶液（6.2.9）调节水样 pH 值至 6.5～8.5，尽量减少酸碱调节液的用量， 以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样 pH 值，按后续步骤进行水样测定。

当 pH 值的影响需要反映在试验结果中或者调节 pH 值会引起水样物理变性或化学反应时，则不调节水样 pH 值。

根据水样测定的实际需求，也可对 pH 值调节前后的水样同时开展试验比较。

8.2.3 溶解氧

按照 HJ 506 方法测定水样溶解氧浓度，确保用于暴露试验（9.3）步骤中的每个稀释水样中初始溶解氧浓度不低于 4 mg/L（大约 50%饱和度）。若要充氧，溶解氧浓度不超过相应饱和溶解氧值。

8.3 样品稀释

8.3.1 预实验

当浓度难以预估时需进行预试验，以稀释比为 10 选择 3 个连续浓度的稀释水样，每一浓度以 5 粒鱼卵按 9.3～9.6 部分进行试验，以确定鱼卵死亡率 100%～0%与稀释水样浓度大致对应的范围。